背景
双特异性抗体（bsAb）和多特异性抗体（msAb）包含多种形式，可以同时结合多个表位，从而解锁解决以前难以治疗或无法治愈的疾病的机制。对候选可开发性的早期评估可以降低潜力较小的抗体的水平，并提升最有希望的候选抗体进行进一步开发。基于蛋白质的疗法具有一套严格的可开发性要求才能具有竞争力（例如高浓度配方和长半衰期），并且它们的评估需要一套强大的方法工具包，其中很少有方法经过验证可用于查询bsAbs/msAbs。
2024年8月27日AbCellera的研究人员在mAbs上发表了一篇名为“Developability considerations for bispecific and multispecific antibodies”的文章，总结了bsAbs/msAbs可开发性评估的关键方面，包括它们的分子形式、免疫原性的可能性、特异性、稳定性、以及大批量生产的潜力。并提供了如何针对特定bsAb/msAb制定综合计划的指导。
抗体形式
bsAb/msAb常见的抗体形式有标准免疫球蛋白G抗体；对称IgG样双特异性抗体；含有scFv和sdAb的双特异性抗体；多价双特异性抗体；多特异性抗体。其中基于IgG的bsAb/msAb形式通常保留Fc区域，可细分为对称或不对称形式。这些bsAbs/msAbs通常依赖于有目的的突变来提高链配对效率，此外还依赖于修饰来改变Fc介导的功能或延长半衰期。基于片段的分子，scFv和sdAb的双特异性抗体没有Fc，并且保留了抗原结合的最低要求，允许不同结合片段的串联。通常引入不同长度的接头，以将具有独特功能特性的不同部分连接在一起。这种抗体组织穿透能力强，结构简单，但是可能会出现高水平的聚集，抗体的溶解度和稳定性较差，抗体半衰期短。含有scFv的双特异性形式或将额外的scFv或Fab连接到IgG支架的多特异性形式通常需要接头，其本身可以引入免疫原性或显着改变PK特性。
bsAb/msAb形式也会因为结合价（即任何靶标的结合部分数量）和结合几何形状（即组装分子中靶向部分的相对方向）的不同而有差异。Zanidatamab是一种HER2靶向双互补位抗体，含有一个单链可变片段（scFv）和一个完整的抗原结合片段（Fab），这种设计使得Zanidatamab能够同时结合HER2受体的两个不同表位，从而增强了受体的聚集和激活，进而增强了补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。
BiTETM（双特异性T细胞接合器）形式是两个scFv分子的融合，是第一个获得商业批准的TCE。一个结合T细胞上的CD3分子，另一个结合肿瘤细胞表面的特定抗原。它可以缩短靶肿瘤细胞和T细胞之间的细胞间距离，显著增强细胞毒效力。
（数据来源 Zhou S, et al. Biomark Res. 2021）
bsAb/msAb除了IgG分子上的差异外，还有其他一些通用组件的不同也会导致它们的格式存在差异，例如多肽接头元件和VHH。多肽接头可分为刚性、柔性和体内可裂解接头，它们不仅用于将不同的蛋白质结构域拴在一起，还可以产生其他作用，例如增加活性、调节PK特性、在体内释放蛋白质结构域或将治疗剂靶向特定组织或器官。通常在这些应用中使用聚甘氨酸-丝氨酸（G4S）n接头的变体，其中总长度经过优化以最大限度地减少聚集倾向，同时保持互补位可及性。接头长度和组成的优化是格式设计的关键组成部分，其中接头变化会影响折叠功效、稳定性和活性。通过点突变降低蛋白酶敏感性，从而改变切割基序，应用稳定框架突变，修改融合几何形状和接头锚点，引入二硫键，改变接头长度，以及添加Glu和Lys残基以提高溶解度来稳定接头。
VHH也称为纳米抗体，通常具有更长，高度可变的互补决定区CDR3环以补偿缺失的VL，这些延伸的CDR3环可实现高亲和力和特异性结合，并通过形成折叠结构帮助屏蔽原本暴露的疏水残基。VHH作为靶向部分是一种有趣的替代品，可使bsAbs/msAbs具有额外的抗原结合能力和价数，具有优异的可开发性，并避免了许多IgG样双特异性形式常见的链配对复杂性。
（数据来源 Madsen AV, et al. MAbs. 2023）
免疫原性
生物疗法可能具有免疫原性，会在患者体内引发对治疗药物本身的不良免疫反应，产生抗药抗体（ADA）。它会降低治疗效果，引起不良反应，甚至会导致副作用。T细胞通过对治疗性抗体中的特定序列作出反应，在确定免疫反应中起着关键作用，这些序列由表达人类白细胞抗原（HLA）的抗原呈递细胞（APC）呈递。
（数据来源 Mattei AE, et al. Front Drug Discov (Lausanne). 2022）
研究发现不同抗体模式（包括TCE、双免疫检查点抑制剂和各种TAA的双重结合剂）的ADA发生率和临床结果各不相同。其中可能影响bsAbs/msAbs疗法免疫原性反应有多种因素，包括产品相关因素、患者相关因素和疾病相关因素。
（数据来源 Vaisman-Mentesh A, et al. Front Immunol. 2020）
产品相关因素
产生对bsAbs/msAbs的免疫原性反应的主要风险决定因素之一氨基酸序列。bsAb/msAb特异性工程通常与其他抗体工程方法相结合，例如人源化突变（将鼠CDR移植到人抗体框架中）和Fc效应子修饰（调节Fc受体介导的效应子功能或通过修改与新生儿Fc受体（FcRn）的结合来延长半衰期）。这些新型工程序列有可能通过引入新抗原或暴露可被APC处理和呈递的隐蔽表位来增加免疫原性，从而依次激活T细胞反应。研究发现在计算机表位预测工具和现有的体外/离体验证试验的联合指导下，使用去免疫和耐受（引入调节性T细胞表位）方法设计低风险抗体构建体，可以降低免疫原性。
A.计算机免疫原性风险评估：计算机模拟T细胞表位筛选和预测可用于筛选T细胞表位的抗体序列（通常为9到15聚体序列），以预测可能与HLA分子结合的序列的存在。例如EpiMatrix、NetMHC、Tepitope、SYFPEITHI等。
（数据来源 Mattei AE, et al. Front Drug Discov (Lausanne). 2022）
同源性建模和分子动力学模拟等技术生成抗体结构的三维模型，可以评估免疫原性的结构特征，例如溶剂暴露环、翻译后修饰和构象灵活性。
（数据来源 Kim J, et al. Trends Pharmacol Sci. 2023）
B. 体外HLAI类和II类结合试验：HLA结合试验在体外评估多肽与不同HLA等位基因的结合能力，并在计算机预测工具中进行补充。结合亲和力和动力学可通过多种方法进行定量，包括荧光光谱法、生化测定（即酶联免疫吸附测定）或SPR。
C. MHC相关肽蛋白质组学：完整的bsAb/msAb分子被加载到体外生成和成熟的单核细胞衍生树突状细胞（DC）上，以使DC能够吸收和处理抗体，然后进行细胞裂解和肽-MHC复合物的分离，随后通过MS测序进行解离和测序。从MAPP获得的数据可以帮助识别可能被设计成免疫原性较低的显性抗原肽序列。MAPP识别的主要抗原序列表明这些序列可能被抗原呈递机制处理和呈递；但它们不一定表明这些序列将转化为T细胞反应。
（数据来源 Jawa V, et al. Front Immunol. 2020）
D. T细胞活化和增殖试验：使用来自健康或患病个体的新鲜分离或冷冻保存的外周血单核细胞 （PBMC）、CD8 T细胞耗尽的PBMC或与单核细胞衍生的DC共培养的分离的CD4 T细胞。这些细胞可以与整个抗体或其肽段刺激，以评估T细胞的活化和增殖。使用特定的T细胞活化标记物（如CD25、CD69、HLA-DR、CD134、CD137）通常与增殖评估相结合，以深入了解T细胞的激活状态和对刺激的反应程度。
（数据来源 Siegel M, et al. Pharmaceutics. 2022）
E. B细胞表位和体外B细胞测定：CD4 T细胞在导致ADA生成的免疫反应中起着至关重要的作用，而B细胞也能直接识别、结合、内化、加工和呈递治疗性抗体的表位至辅助T细胞，导致幼稚B细胞分化为记忆细胞和浆细胞，产生高亲和力（IgG）ADA。目前缺少强大的体外B细胞检测，但已经开发了几种用于预测B细胞表位的计算机工具，例如免疫表位数据库和分析资源（IEDB）和SEPIa，这些预测方法中的许多都使用序列衍生的特征，包括氨基酸组成、亲水性、表面可及性、β转角和骨架灵活性来提高B细胞表位预测性能。
患者相关抗体风险
在临床药物开发阶段，需要考虑对未用过药物的受试者实施预先存在的反应性的筛选和表征策略。
例如JNJ-61178104（以前称为COVA322）bsAb，它建立在Adalimumab单抗的骨架上，由于快速记忆回忆反应，对先前生物治疗的ADA反应可能导致对bsAb/msAb的免疫原性反应增强。因此，应考虑筛查患者中预先存在的反应性，特别是对于有生物治疗史的患者。
治疗相关风险因素
治疗相关的风险因素，包括给药途径、剂量、给药方案、治疗持续时间以及使用免疫调节合并用药，都是导致生物制剂（包括bsAbs/msAbs）免疫原性风险的因素。大多数治疗性抗体是通过皮下和静脉给药的，与静脉注射相比，皮下注射通常需要以高浓度给药，因此可能会引起更强的免疫原性反应风险（ADA）。msAb/msAb的较低剂量可能会导致对ADA介导的增强药物清除的敏感性增加，并且PK和PD性能不理想。与抗炎药物或化疗联合治疗也可能影响bsAbs/msAbs 的免疫原性潜力。
作用机制危险因素
分子不同，对应的免疫原性可能有高有低；与共刺激途径激动或拮抗抑制途径的免疫调节性 bsAbs/msAb可能会增加免疫原性的风险，据报道，针对TIM-3和PD-L1的bsAb LY3415244可在所有服药患者中诱导ADA。由于bsAbs/msAb可以与多个靶标结合，因此形成免疫复合物的风险可能更高。大型免疫复合物通过多种机制增强免疫原性反应，例如增加APC的摄取，以及通过B细胞受体的交联和激活激活B细胞不依赖性地激活B细胞。
（数据来源Hellmann MD, et al. Clin Cancer Res. 2021）
特异性
在bsAbs/msAbs生产过程中可能会出现多特异性（蛋白质组中的脱靶结合）和多反应性（与带电或疏水的蛋白质、膜或其他生理表面的非特异性结合），会改变功效和清除率，这些不良影响会导致脱靶毒性、免疫原性和可制造性挑战。多特异性可由多种机制引起，例如不相关靶标的分子模拟或CDR中的可塑性，同一抗体上有多个旁位会加剧这些特征。多反应性归因于不良的抗体表面特性，例如正电、负电和疏水表面斑块或Fv和Fc的电荷不平衡。CDR上带大量电荷或疏水性较强的抗体的清除率会加快，从而对其治疗效果产生负面影响。建议在重组为bsAbs/msAbs之前需对亲本分子进行评估。
（数据来源 Cunningham O, et al. MAbs. 2021）
计算机预测：已经开发出许多计算机计算工具来评估抗体特征以预测多反应性和特异性，抗体特征（例如序列组成、CDR长度和表面特性（即电荷和疏水性）通常源自同源性模型）已用于创建多反应性和相关特异性的预测模型。
体外特异性实验：PK特性评估是与特异性相关的主要可开发性特性，主要取决于抗体Fc段与 FcRn在不同pH条件下的特异性结合。双特异性/多特异性抗体通常会显著改变Fc-FcRn相互作用，从而影响PK特性，因此需要评估不同抗体格式的FcRn结合特性。除了Fc段，抗体Fv区的电荷、靶点结合、多特异性/多反应性以及糖基化等特性也可能导致不期望的清除加快，从而影响PK特性，需要综合考虑。除了疏水性和电荷等因素，使用人类细胞微阵列技术可以在体外分析人类蛋白质组，以降低脱靶毒性和体内加速清除的风险。
（数据来源 Cunningham O, et al. MAbs. 2021）
稳定性
抗体的稳定性包括许多分子内在因素和药物相关的外在因素，包括热稳定性、胶体稳定性、蛋白水解抗性和血液中的化学稳定性。这些方面的缺陷可能导致制造过程中出现困难、影响保质期以及改变抗体的免疫原性和活性。
热稳定性：在开发bsAb/msAb之前需要对亲本抗体的热稳定性进行评估，常用的评估热稳定性方法有差示扫描量热法（DSC）和差示扫描荧光法（DSF）。使用不需要对Fv区域进行突变的bsAb/msAb形式，例如VHH域，可以完全避免因重新格式化而导致的热稳定性不可预测性下降。一些工程化的方法被开发开发用来避免热稳定性的损失，类似的靶向域的方法包括在VH-VL和CH1-CL界面，在单链scFvs的可变域之间，或在单链scFvs的连接子和可变域之间引入二硫键。
化学稳定性：基于抗体的治疗剂的化学稳定性可能受到多种不同的降解途径的影响，包括脱酰胺、异构化、氧化、二硫键交换N端焦谷氨酸形成、C端赖氨酸剪切、碎片化和糖化。其中碎片化可以分为非酶碎片化和酶碎片化，非酶碎片化常见于抗体中，主要发生在恒定区，由于其动态环结构，上铰链区发生的可能性最高。非酶碎裂事件经常发生在Asp、Gly、Ser、Thr、Cys或Asn残基上，除甘氨酸外，这些残基可通过其侧链介导碎裂事件。酶促碎裂通常由在mAb和bsAbs/msAbs生产和纯化过程中发生的蛋白酶裂解介导，铰链区是酶切最常见的位点。抗体可能会发生非酶促的糖基化反应，主要发生在赖氨酸侧链氨基和N端氨基上，糖基化可能会影响抗体的亲和力和功效，并增加聚集。
胶体稳定性和粘度：胶体稳定性和粘度是高浓度治疗性bsAbs/msAbs制剂需要考虑的重要特性。抗体的粘度受多个因素影响，包括分子量大小、电粘性效应以及蛋白质间相互作用，由于bsAbs/msAbs抗体可能会产生新的相互作用以及复杂的结果和更大的分子量，将单克隆抗体重新格式化为bsAbs/msAbs可能会导致粘度增加。从蛋白质序列计算的Fv净电荷或结构可指示潜在的粘度风险。选择具有良好低粘度行为的bsAbs/msAbs，以适应其预期的给药途径。Fv电荷<2的抗体被认为具有更高的风险，因为它们可能具有带负电荷的斑块，这些斑块可能会驱动恒定域中带正电荷的斑块的自缔合。此外，Fv电荷对称参数（VH和VL净电荷的乘积）可指示由于自缔合而导致的粘度风险。
体内稳定性：抗体在给药后数天或数周内的体内理化稳定性，会影响药效、清除和免疫原性。与单克隆抗体类似，双特异性/多特异性抗体也需要具有长半衰期的药代动力学特征。体内抗体可能会发生脱氨基化、异构化、氧化、糖化、二硫键改变、N端焦谷氨酸形成、C端赖氨酸切割和蛋白水解等生物转化。这些生物转化事件可能会影响抗原结合能力和药效。此外，血清中的环境也可能导致二硫键重排，尤其是IgG2和IgG4亚型。
可制造性
可制造性是分子可开发性评估的一个组成部分。通过可制造性评估，可以更深入地了解分子行为，从而设计出兼顾质量和数量的制造工艺和控制策略。及早识别工艺和分析开发的CQA和风险可以减轻开发挑战。
上游工艺注意事项：蛋白质滴度、细胞系稳定性、群体倍增时间、翻译后修饰，载体和序列设计、克隆性和正确组装都是需要考虑的因素。
下游工艺注意事项：下游工艺中需要分离和去除上游产生的错误配对的bsAb/msAb分子。许多双特异性和多特异性形式会引入大量形式特异性杂质，这对许多分析和纯化方法构成独特的挑战。这些形式特异性杂质在生物物理性质（例如分子量和等电点（pI））上可能与所需的双特异性产物几乎相同，因此需要开发定制的分析分析和/或纯化方法。一般在大规模生产中有许多方法用于分离杂质，包括，根据pH和pI的离子交换色谱，针对变体之间的疏水性差异的疏水相互作用色谱法，或依靠独特的特性组合通过多模式色谱法实现分离。
总结
bsAbs/msAbs的可开发性评估的关键方面，包括它们的分子形式、免疫原性的可能性、特异性、稳定性、以及大批量生产的潜力。过去几年中已有数百种bsAb/msAb分子进入临床研究。同时作用于体内多个靶点的能力为药物开发提供了组合机会，并有望改变许多疾病的治疗前景。因此，用于设计和评估这些独特分子的方法必须不断发展，以抓住这一机遇并为患者带来价值。