背景

免疫系统正常运作所需的IgG抗体通过其Fab区识别抗原并中和病原体，通过其Fc区与宿主的Fcγ受体（FcγR）结合向免疫系统发出信号。这些FcγR相互作用启动并调节抗体介导的效应功能，这对于宿主免疫、治疗性单克隆抗体的有效性以及IgG介导的病理至关重要。FcγR包括激活受体和抑制受体，IgG Fc区与产生相反信号的FcγR相互作用的相对结合亲和力是免疫反应的关键决定因素。大量研究致力于了解和操纵FcγR相互作用，以揭示其基本生物学活性，并开发具有定制效应功能的治疗性单克隆抗体。

（数据来源 Delidakis G, et al. Annu Rev Biomed Eng. 2022）

 2025年4月1日美国埃默里大学的研究人员在bioRxiv上发表了一篇名为“Mapping affinity and allostery in human IgG antibody Fc regionFcγ receptor interactions”的文章。研究人员使用了Fc区的饱和突变文库，利用人类IgG1 Fc区域来测定超过98%的所有可能的单点氨基酸替换对所有人类FcγR的有效亲和力，以及最常见的FcγR多态性。对决定Fc稳定性、FcγR结合的正构控制以及FcγR结合的短程和长程别构控制的Fc氨基酸变异进行了全面分析。还预测了几乎所有可能的单点Fc突变的相对激活与抑制效应功能能力。

建立用于IgG1 Fc区域的哺乳动物细胞表面展示平台

通过改造慢病毒表达系统，使其包含人类IgG1的铰链和Fc区域（包括216-447位的残基）。在这个构建体中，IgG1 216-447由源自IgG4的N端信号肽（SP）和来自血小板衍生生长因子受体（PDGFR）的C端跨膜（TM）区域所框定，其间插入了一个Myc标签以监测表达的变化。将这个构建体克隆到了一个包含3’内部核糖体进入位点（IRES）和绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒表达质粒中，GFP作为选择标记。

在哺乳动物HEK293T细胞表面表达IgG1 216-447的稳定细胞系，并评估了人FcγR与之结合的情况以验证该系统。将细胞与不同浓度的单个FcγR进行孵育，随后用荧光标记的链霉亲和素和抗Myc抗体对细胞进行染色，分别定量FcγR结合和IgG1 216-447细胞表面表达。通过这种方式测得的表面展示的IgG1 Fc-FcγR相互作用的KD值与通过相同Fc-FcγR相互作用的表面等离子共振（SPR）分析得出的已发表数据一致。在HEK293T细胞表面表达时，IgG1 216-447的每个Fc原子簇会作为同源二聚体配对，从而具备与FcγR结合的能力。

IgG1 Fc深度突变扫描库的细胞表面展示

研究人员计了一个涵盖IgG1 216-447所有可能氨基酸替换的位点饱和型库，并保留了野生型表面展示的侧翼区域。并通过PCR扩增在IgG1 216-447终止密码子后立即插入15核苷酸的随机条形码。经PacBio长读长测序，产生了包含独特条形码与氨基酸突变体关联的查找表，突变覆盖率为98.9%，仅2个位置（242和431）由于输入库未能产生突变而缺失。每个变体平均与九个不同的编码条形码相结合，绝大多数变体是单位点替换。

抑制细胞表面展示的IgG1 Fc突变主要位于CH2结构域的核心区域

Fc突变会改变蛋白质稳定性，CH2结构域中负面影响Fc细胞表面展示的位点数量远多于CH3结构域（十三个对两个），而且CH2结构域中每个这些位点对不同氨基酸的替换耐受性也远低于CH3结构域中的位点。CH2结构域通常在单克隆抗体中的合作折叠单元（单个Ig域）中表现出最低的熔点，并且增加其稳定性对于设计具有改进的生物物理和可开发性特性的治疗性单克隆抗体具有极大的价值。

绘制IgG1 Fc突变导致更紧密和更弱的FcγR结合

将IgG1 Fc深度突变扫描库在HEK293T细胞中进行表达，针对GFP+/Myc+细胞进行筛选。Asn297的所有突变都取消了Fcγ-R3a-158v的结合，该位置的所有非天冬酰胺氨基酸的结合分数都很高。Asn297与Fc-γ-R结合至关重要的N-聚糖相连。与FcγR3a-158v界面形成的IgG1 Fc残基的突变，因为它们的结合能力较弱，在Fc-FcγR3a-158v界面的远端有许多残基表现出显著的更紧密和更弱的结合能力，表明一系列变构效应可以导致FcγR3a-158v结合亲和力的增加和减少。

IgG1 Fc单位点氨基酸替换对FcγRs的有效亲和力

使用高分辨率深度扫描滴定分析揭示人类IgGFc中四个连续基于序列的区域，其中突变通常会导致与所有人类FcγRs的结合减弱，包括大约230-240、262-272、291- 300和323-331位点，涵盖下铰链区和三个Fc环，这些区域至少包含一些直接与FcγRs接触的残基。有两个通常导致更强FcγR结合的Fc区域，分别位于370-379和394-407位点，这两个位点均位于Fc甲基域内，从CH2-CH3连接处延伸到CH3-CH3界面。突变后典型地降低结合亲和力的Fc区域位于Fc-FcγR界面或附近，而突变后典型地增强结合的Fc区域则远离Fc-FcγR界面。

比较Fc突变对所有低亲和力FcYRs的影响

Fc突变驱动抗体介导的效应功能的关键参数是它们对激活（FcγR2a和FcγR3a）与抑制（FcγR2b）低亲和力FcγR的相对亲和力。通常以亲和力比值表示，即与一种抑制性FcγR的亲和力比一种激活性受体的亲和力，或I:A比值。由于FcγR2b是唯一的抑制性FcγR。将激活型FcγR和FcγR2b之间的差异有效亲和力映射到各自的激活型Fc-FcγR复合物上，Fc突变体的位置表明，最具激活作用（即最低I:A）的通常聚集在Fc-FcγR结合界面，最具抑制作用（即最高I:A）的则分散在整个Fc中，并且通常远离Fc-FcγR界面。

深度突变扫描数据的生物物理学验证

深度突变扫描数据通过表面等离子共振（SPR）和差示扫描荧光法（DSF）验证显示，其预测的Fc与FcγRs结合亲和力及Fc突变对稳定性的影响与实验测定结果高度一致，证实了DMS数据的可靠性和准确性。

对Fc-FcγR结合的别构效应局限于Fc区域的特定区域

对FcγR结合影响较大的是距离受体重心50-60 Å的那层，这层包括每个Fc单体上的CH2-CH3界面残基，以及Fc二聚体界面的朝向受体的残基。这些残基对Fc区域的结构至关重要，观察到的结合亲和力变化表明这些结构变化正在对Fc-FcγR结合界面产生别构效应。在50-60 Å层内，ΔlogKA的平均效应要么是正的，要么是微弱的负的，表明这一层可用于工程化具有不同亲和力的Fc变体，以靶向活化和抑制性FcγR。

D376T在改善激活方面最有效，并且构成了一个可以突变以改善激活的更大残基网络的一部分（S375W、D376T和P395V）。这些残基都朝向受体并且靠近两个Fc链之间的界面。T307是唯一同时满足这两个标准的残基：如果将其转换为半胱氨酸，激活会改善；如果将其转换为苯丙氨酸或亮氨酸，抑制会改善。这表明该残基是工程中的一个有前途的靶点。T307位于CH3和CH2域的界面处，表明Fc的这一部分对受体结合施加了别构控制。20-30 Å层内的所有18种突变都改善了抑制，而没有一种改善了激活，表明Fc结合界面的残基可能特定地进化为与激活受体结合而不是抑制受体。

组合Fc突变的协同效应

IgG1 Fc突变组合对FcγRs结合的协同效应整体较弱，多数突变组合的效应接近加和，中位协同效应接近于零，表明大多数突变独立影响FcγR结合。但存在部分突变组合展现出明显的正协同或负协同效应，这些突变组合的效应显著偏离加和，为Fc工程提供了潜在的优化靶点。

总结

IgG1 Fc与FcγRs的相互作用受到多种因素的影响，包括直接的结合界面和变构效应。改变Fc与激活型和抑制型FcγRs的相对亲和力可以调控I:A比率，这对于设计具有特定免疫效应功能的治疗性抗体至关重要，通过调节免疫反应的强度和类型，对于治疗多种疾病（如癌症和自身免疫疾病）具有重要意义。深度突变扫描技术（DMS）的全面性和系统性使得能够评估几乎所有可能的IgG1 Fc单一位点突变和约1%的所有可能的双突变对所有人类FcγR的影响。该数据提供了迄今为止对Fc-FcγR相互作用的最全面分析，以及对Fc区域与激活和抑制性FcγR之间相互作用如何通过别构效应调节的前所未有的见解。但其也存在未包括所有可能的组合突变，依赖于哺乳动物细胞的内源性糖基化机制，限制了Fc糖基化形式的多样性的局限性，未来需结合更复杂文库与糖基化改造进一步探索。