背景

多特异性抗体的发现和开发在优化其物理化学特性以提高可开发性和可制造性方面带来了独特的挑战。常见的可开发性挑战包括增加的聚集风险、高粘度、溶解度差、低表达产量、复杂的纯化要求、更高的片段化倾向、免疫原性或药代动力学。

2025年9月1日Vanessa Siegmund团队在MAbs上发表了一篇名为“Optimizing colloidal stability and viscosity of multispecific antibodies at the drug discovery-development interface: a systematic predictive case study”的研究，研究了源自父本NKp30 × EGFR自然杀伤细胞接合子（NKCE）分子的工程化双特异性IgG1-VHH构建体的溶液行为，胶体稳定性、疏水性、热稳定性、pH敏感性和粘度。通过结合计算机模拟 预测和实验评估，对具有改变的抗原结合片段（Fab）和可变结构域（VHH）的变体进行了工程化，并在广泛的配方相关pH范围内（pH 4.5–8.0）对其进行了表征。研究结果表明，在双特异性抗体的可变结构域中，使pI值稍微碱性（约7.5–9.0）可以有效缓解在标准酸性配方中可能引起的电荷不对称性，从而导致不利的溶液行为。合理的设计和早期的实验验证产生了优化的变体，其胶体稳定性和粘度显著改善，与起始分子相比。这项系统研究是首次对双特异性抗体进行此类研究，强调了整合域级计算模拟的价值。在抗体设计早期进行评估，促进对多特异性生物疗法在溶液中表现改进的高效优化。

Fab和VHH变体的设计及域和完整构建的计算机模拟评估

对双特异性NKp30×EGFR NKCE，Fab M-Fc-VHHL的初步计算机评估显示，Fab结构域的计算pI为8.4，VHH的pI为4.5。这导致这些结构域在5.5至8.0的pH范围内产生相反的电荷，从而产生电荷不对称，从而触发静电诱导的自相互作用，并可能导致聚集和不良的溶液行为。

设计涵盖广泛pI和电荷曲线的变体。将特定突变引入VHH和Fab区域，以产生具有低、中和高pI值的变异（称为VHHL、FabL、VHHM、FabM、VHHH和FabH）。

通过SEC实验发现Fab H-Fc-VHHH和Fab M-Fc-VHH H构建体的滴度最低（分别为36.9和34.5 mg/L）。

蛋白质工程显著提高了相关制剂缓冲液中的胶体稳定性

结合了专为更高pI设计的Fab和VHH变体Fab H-Fc-VHHM和FabH-Fc-VHH H，在pH 4.5、5.5和6.5的制剂缓冲液中表现出良好的胶体稳定性，而仅在pH 8.0下表现出不利的稳定性。这些发现与FabH、VHHH、VHHM和Fc结构域在这些pH值下的计算电荷曲线非常吻合，其中所有结构域在pH 6.5时都显示出正电荷，仅在pH 8.0时才出现电荷不对称。

Fab-Fc变体：胶体稳定性随Fab结构域pI的升高而改善。高pI变体FabH-Fc在整个pH范围内表现最佳。

Fc-VHH变体：大多数情况下，较高的VHH pI也带来更好的胶体稳定性，但存在例外（如Fc-VHHL在pH 5.5下稳定性意外较好），提示除净电荷外还有其他因素（如铰链区灵活性）在起作用。

双特异性构建体：组合使用高pI的Fab和VHH结构域，是获得最佳胶体稳定性的有效策略。结果表明，当所有结构域（Fab，Fc，VHH）在制剂pH下都携带足够高的正电荷时，静电排斥力最大化，稳定性最好。

优化后的分子具有更低的疏水性

HIC分析表明含有低pI VHH结构域（VHHL）的构建体表现出更长的保留时间，意味着疏水性更高或构象稳定性更差。这种疏水性的差异并非通过引入疏水突变造成，而是由电荷分布改变间接导致，凸显了蛋白质性质的复杂性。优化构建体（使用VHHH或VHHM）具有更短的HIC保留时间，表明其具有更有利的疏水特性，这有助于降低聚集倾向。

蛋白质工程提高了所有制剂缓冲液中优化构建体的热稳定性

所有构建体均表现出可接受的热稳定性（Tm1 > 55°C）。在pH 6.5和8.0下，几种构建体在pH 4.5和5.5时显示出低于50°C的Tonset值。优化构建体在整个pH范围内的热稳定性均优于起始分子。热稳定性主要由最不稳定的结构域决定。在含有VHHL的构建体中，VHHL是首先展开的结构域；而在其他构建体中，Fc的CH2结构域通常是低构象稳定性，尤其是在酸性pH下。

计算机与实验数据相关性确认

相关性分析发现，实验测得的胶体稳定性（kD值）与计算机计算的结构描述符之间存在中度但明确的关联：确定了与正电荷表面斑块的比例（Spearman r = 0.57），与负电荷表面斑块和疏水斑块的比例之间的相关性。这验证了表面电荷分布是驱动胶体稳定性的关键物理因素，并支持使用计算机工具进行早期预测。

工程变体显示出良好的pH敏感性（病毒灭活稳定性）

pH敏感性测试对于评估治疗性抗体的稳定性和安全性至关重要，特别是关于其对病毒灭活 （VI） 的敏感性。除Fab L-Fc-VHHL外，所有构建体在2 mg/ml时对极端pH条件和再缓冲过程表现出强大的耐受性。大多数工程变体，包括亲本和优化构建体（Fab H-Fc-VHH H和Fab H-Fc-VHH M），在给定浓度（2 mg/ml）的极端pH条件下保持稳健的稳定性，凸显了它们对涉及病毒灭活步骤的制造工艺的适用性。

优化的双特异性构建体显示出更好的粘度特性

与起始分子相比，优化后的构建体表现出明显更快的上浓度动力学，突显了它们对高浓度制剂的增强适用性。优化构建体的粘度显著低于起始分子。这种粘度特性是由高度带电的Fab H结构域提供的强静电排斥力以及在此pH下VHH M或Fc结构域不存在电荷不对称性或吸引性相互作用共同作用的结果。通过减轻电荷不对称性，可以有效降低由静电吸引引起的高粘度问题，这对于开发高浓度皮下注射制剂至关重要。

结论

研究结果表明，通过合理的电荷和 pI 工程可以有效地减少静电驱动的自相互作用，从而提高多特异性抗体在酸性配方缓冲液中的胶体稳定性和粘度。将可变区pI 范围优化在约7.5–9.0，以特别减少酸性配方中的静电自相互作用。虽然pI和电荷描述符提供了一种实用的早期阶段策略来降低与静电自缔合相关的风险，但抗体溶液行为本质上具有多因素性。其他物理化学特性，如构象稳定性、疏水性、连接子设计和配方架构，受其他部分独立的决定因素控制，可能需要针对具体情况进行筛选和优化。未来研究将扩展这些见解到不同的多特异性抗体格式，并系统地探索其他分子因素，包括连接子设计，以及配方参数，这将进一步完善预测模型，并支持下一代抗体疗法的合理设计。