服务支持

迈思生物承担了HSPA9和PINKI的重组蛋白表达，动力学模拟以及SPR检测服务。

背景

椎间盘退变（IVDD）的临床治疗面临巨大挑战，髓核细胞（NPCs）依赖线粒体稳态来维持生存、基质代谢和抗氧化应激能力。脂肪来源的干细胞（ADSC）衍生的囊泡正被探索作为IVDD的无细胞疗法，因为它们能够调节NPC的氧化应激、炎症、细胞死亡和基质代谢。供体细胞衰老是一个挑战。衰老细胞会改变外泌体（EV）的分泌和内容物组成，而与衰老相关的囊泡还可向邻近细胞传递应激信号。因此，在ADSC衍生囊泡治疗的背景下，关键问题不仅在于囊泡是否被NPC摄取，更在于其是否传递了功能正常的或受损的线粒体物质。在衰老应激条件下，PINK1标记的线粒体是否能够被重新导向至细胞外MV（微囊泡）的排出尚不明确。如果这一途径成立，将把供体细胞中线粒体质量控制缺陷转化为一种细胞间转移机制，用于输送线粒体DAMPs（线粒体损伤相关分子）。目前仍不清楚连接受损线粒体与MV生物合成的分子适配蛋白，以及这种分选决定如何影响MV的功能。

2026年华中科技大学同济医学院附属协和医院的欧子暄在Advanced Science上发表了一篇名为“Donor-Cell Senescence Redirects PINK1-Marked Mitochondrial Cargo From Mitophagy to Microvesicle Transfer Through SUMO3-Stabilized HSPA9”的研究，研究显示，衰老的脂肪来源干细胞（ADSCs）可将受损线粒体重新导向微囊泡（MV），从而将保护性囊泡转变为促退变的载体。来自衰老ADSC的MV富含PINK1标记的氧化损伤线粒体货物被转运至髓核细胞（NPCs）后，会破坏受体细胞的线粒体稳态，激活cGAS-STING-NLRP3炎症通路，并加剧椎间盘退变。HSPA9是线粒体货物分选适配蛋白。衰老应激诱导HSPA9在K612位发生SUMO3连接，从而通过限制泛素-蛋白酶体降解稳定HSPA9。稳定的HSPA9利用其肽结合结构域与活化的PINK1激酶结构域相互作用，并将PINK1阳性受损线粒体连接到Annexin A1相关的囊泡结构上。这一SUMO3-HSPA9-PINK1模块使受损线粒体从PINK1- Parkin线粒体吞噬途径转向通过囊泡介导的线粒体转移。通过重编程供体细胞以抑制受损线粒体的释放并增强线粒体吞噬清除，可恢复衰老的ADSC来源微血管内皮细胞在体内的治疗效果。这些发现表明，线粒体货物的命运是介导囊泡修复与退化之间的一种开关。

衰老的ADSC来源的MVs失去其保护作用并加剧NPCs的线粒体炎症损伤

在受体NPC中，正常ADSC来源的MVs（MVnormal）可恢复H₂O₂损伤NPC的线粒体膜电位、减少ROS积累、抑制cGAS-STING-NLRP3炎症通路。衰老ADSC来源的MVs（MVstress）不仅丧失保护作用，反而维持并增强cGAS/STING/NLRP3表达，加重NPC线粒体炎症损伤。体内实验发现在大鼠尾椎间盘穿刺IVDD模型中，MVnormal部分保留T2信号、减轻退变，而MVstress无法改善MRI退变评分，未能发挥保护作用。

衰老ADSC优先释放富含受损线粒体的MVs

MVs比小细胞外囊泡（sEVs）携带更多线粒体组分。MVstress中富集PINK1、VDAC1、TOMM20等线粒体蛋白，且这些线粒体Cargo具有膜电位下降、蛋白质羰基化增加、MDA升高等氧化损伤特征。衰老还增加MVs整体释放量（通过MLC1/ROCK1/RhoA/ARF6通路调控）。

HSPA9介导PINK1标记的受损线粒体被分选至衰老的ADSC衍生外泌体中

蛋白质组学筛选发现HSPA9位于"线粒体相关蛋白"与"蛋白质转运相关蛋白"的交集。HSPA9是关键的交叉调控节点。HSPA9通过其肽结合结构域（PBD）识别应激激活的PINK1激酶结构域。

HSPA9可能参与将受损线粒体分选到衰老ADSCs的MV中。亚细胞组分分析显示，H2O2增加了HSPA9的胞质池，而全长PINK1主要仍与线粒体组分结合，并在损伤后积累。H2O2处理显著增强了HSPA9与VDAC1和PINK1的相互作用。VDAC1是一种线粒体外膜蛋白，在去极化或受损后会稳定地积累在外膜上，作为受损线粒体质量控制的标志物。 因此，增强的HSPA9-VDAC1/PINK1相互作用表明，HSPA9参与捕获PINK1标记的受损线粒体。H2O2也增加了HSPA9与Annexin A1之间的相互作用。ELISA分析显示HSPA9敲低选择性减少VDAC1释放而不影响Annexin A1整体输出，表明HSPA9主要调控线粒体cargo分选而非整体MVs产生。最后，HSPA9敲低改善MVs线粒体cargo功能质量，表现为JC-1比率升高及蛋白质羰基化和MDA水平降低。

SUMO3依赖性SUMO化调控HSPA9功能

Reactome通路分析显示MVs中差异表达蛋白显著富集于多种SUMO化相关通路，包括RNA结合蛋白SUMO化、DNA复制蛋白SUMO化、泛素化蛋白SUMO化及DNA损伤应答蛋白SUMO化等。在ADSCs内部，H2O2处理也增加了SUMO1和SUMO2/3共轭蛋白，表明在衰老应激下SUMO化全局激活。HSPA9免疫沉淀结果显示，HSPA9相关的SUMO2/3共价连接远强于SUMO1共价连接，表明HSPA9主要与SUMO2/3相关的修饰相关。SUMO2/3免疫沉淀能轻易富集HSPA9，而HSPA9在SUMO1免疫沉淀中的信号较弱。在H2O2处理下，HSPA9相关的SUMO2/3共价连接进一步增加，而SUMO1相关的信号保持相对较弱。衰老应激主要通过SUMO2/3而非SUMO1诱导HSPA9的SUMO化。药理学调控实验显示，TAK981（SUMO活化酶抑制剂）减少H2O2‐诱导的SUMO2/3共价物积累，而SENP1-IN-3进一步增加了SUMO2/3共价化。

通过SUMOplot、JASSA和GPS-SUMO三种算法交叉预测，K612被鉴定为唯一共享的高置信度SUMO化位点。K612并非一个通用的SUMO2/3受体位点，而是SUMO3依赖性HSPA9修饰所必需的关键赖氨酸。SUMO3敲低增加了HSPA9的泛素化，提示SUMO3修饰与HSPA9的泛素依赖性降解之间存在拮抗作用。CHX追逐实验也显示，SUMO3敲低后HSPA9的降解加速，证实SUMO3对HSPA9蛋白的稳定性是必需的。K612处的SUMO3修饰不仅影响HSPA9的修饰状态，还影响其将PINK1标记的受损线粒体与MV相关的膜结构连接的能力。SUMO化通常通过改变蛋白质的稳定性、定位或相互作用状态来调节蛋白质功能。使用蛋白酶体抑制剂MG132恢复了HSPA9 K612R水平，表明K612R引起的失稳主要依赖于泛素-蛋白酶体途径。SUMO3敲低降低了HSPA9蛋白水平，而MG132部分恢复了HSPA9表达，表明SUMO3的缺失促进了HSPA9的蛋白酶体降解。这些数据表明，K612 SUMO化是一种功能决定因素，它通过限制泛素-蛋白酶体介导的降解来稳定HSPA9，并支持HSPA9依赖的线粒体货物分选和下游促炎活性。

激活的PINK1直接结合HSPA9以许可受损线粒体货物分选

先前的研究表明，HSPA9在衰老ADSCs中作为受损线粒体装载至MVs的核心衔接蛋白。通过AlphaFold3结构预测、分子动力学模拟、SPR表面等离子共振和酵母双杂交实验，多种实验证实HSPA9与PINK1的直接结合。结合亲和力KD约为4.7×10⁻⁷ M（亚微摩尔级）。PINK1激酶活性对其与HSPA9互作至关重要；CCCP诱导的线粒体去极化增强二者互作。敲低PINK1减少MVs中HSPA9和VDAC1的装载。说明应激激活的PINK1是一个线粒体识别平台，它能结合HSPA9并支持将受损线粒体货物选择性地装载到MVs中。

线粒体自噬与HSPA9介导的MVs输出存在竞争平衡

PINK1标记的受损线粒体通常通过PINK1-Parkin介导的线粒体自噬在细胞内被清除。当HSPA9介导的受损线粒体MV（微囊泡）外排被阻断时，PINK1标记的线粒体会被重新导向细胞内与线粒体自噬相关的处理途径。H2O2降低了ADSCs中的线粒体膜电位和ATP水平，并诱导了ROS的积累。3-MA进一步加剧了线粒体功能障碍，而RAPA和NMN部分恢复了线粒体膜电位和ATP的产生，并降低了ROS水平。促进线粒体自噬或改善线粒体稳态可减轻衰老ADSCs中的线粒体损伤，而抑制自噬则会加剧受损线粒体的积累。这些发现揭示了衰老ADSCs中线粒体质量控制的命运转换，即PINK1标记的受损线粒体在PINK1-Parkin介导的线粒体自噬清除与HSPA9介导的装载至微囊泡（MVs）之间动态分配；当细胞内线粒体自噬不足时，这种平衡会转向细胞外排，从而将未解决的线粒体损伤转化为可传播的促炎信号。

供体细胞重编程可恢复衰老性ADSC来源微血管内皮细胞的治疗效果

通过联合使用NMN（恢复衰老ADSC线粒体稳态）和si-HSPA9（阻断受损线粒体向MVs的分选）对衰老ADSC进行重编程处理，产生的修饰MVs（MVmodified）在体外显著改善H₂O₂损伤NPC的线粒体膜电位、减少ROS积累并抑制cGAS-STING-NLRP3炎症通路。NMN主要恢复衰老ADSC的线粒体功能状态，而si-HSPA9特异性阻断HSPA9依赖的受损线粒体cargo进入MVs的途径，两者联合产生协同效应。MVstress减少了I型胶原和NLRP3信号，并恢复了聚集蛋白聚糖的表达，表明减轻了IVDD中类纤维化基质重塑、基质丢失和炎症激活。MV stress减少了椎间盘组织中的cGAS和STING信号，而MV stress维持了强烈的cGAS/STING激活。因此，恢复供体细胞的线粒体稳态同时限制HSPA9依赖的货物分选，可以恢复MV stress的治疗活性。

小结

本研究揭示供体细胞衰老通过SUMO3-K612修饰稳定HSPA9，使其识别PINK1标记的损伤线粒体并将其分选至微囊泡，与线粒体自噬形成竞争。衰老ADSC来源的MVs富集损伤线粒体，通过cGAS-STING-NLRP3通路加剧受体髓核细胞炎症与椎间盘退变。联合NMN恢复线粒体稳态并沉默HSPA9可阻断损伤线粒体输出，有效恢复MVs治疗效力，为IVDD无细胞治疗提供供体细胞重编程新策略。