背景

重组蛋白在食品、生物医学和科学等领域有着广泛的应用。原核表达系统因其快速生长和高产蛋白而成为重组蛋白生产的首选平台。然而，重组表达环境和自然生理条件之间的差异经常导致蛋白质错误折叠，导致聚集成无功能的包涵体或蛋白水解降解。

2026年1月江南大学食品科学与资源教育部重点实验室在Bioresour Technol发表了一篇名为“Optimizing protein folding in prokaryotes: Strategies to enhance soluble expression of recombinant proteins”的文章，介绍了两种互补的解决方案：内在分子再设计（截断、理性设计/定向进化、祖先重建和返祖突变）和外源性折叠调节（分子伴侣过表达、添加化学伴侣和融合标签纳入），并分析了它们的机制。系统总结了优化蛋白质折叠的相关方法。通过强调机制研究与实际案例研究的结合，以及将人工智能驱动的折叠预测与高通量筛选平台相结合的前瞻性方法，增强原核表达系统中重组蛋白的正确折叠并促进其可溶性表达。

重组蛋白的分子修饰

已开发出多种分子修饰方法，包括截短表达、理性设计、定向进化以及新兴的祖先序列重建技术；这些方法可通过调控结构域间的相互作用、表面理化性质或进化路径来提高折叠效率。

截短表达：与较大的多结构域蛋白质相比，具有单一结构域的蛋白质更有可能成功表达。而具有多个结构域和复杂结构的高分子量蛋白质则更倾向于形成包涵体。某些结构域或区域可能与其它结构域的整合并不紧密，对其催化性能的影响也较为有限；移除这些区域可降低能量垒、减少折叠过程中的构象选择空间，从而简化折叠过程、促进稳定结构的形成，并提升折叠效率。构建多结构域蛋白的截短突变体已被证明是改善重组蛋白折叠质量并提高其溶解度的有效策略。

工程化调控构象动力学与表面性质：理性设计方法主要依赖于蛋白质家族的序列比对分析、预测可能阻碍蛋白质折叠和结构稳定性的位点或区域，以及通过分子修饰来提高重组蛋白的溶解度并增加其产量。将蛋白质中的非保守氨基酸残基转换为保守氨基酸残基有助于稳定蛋白质 结构并提高其可溶表达水平。对β-折叠区进行靶向修饰（例如增强氢键或静电排斥作用）可有效减少聚集现象。

祖先序列重建（ASR）技术：祖先序列重建（ASR）技术为增强蛋白质折叠自主性提供了新的进化解决方案。该方法通过系统发育分析和生物信息学分析，能够从已知现存序列推断出合理的祖先序列。祖先蛋白质依赖于自主折叠（不依赖分子伴侣），而现代蛋白质则与宿主特异性分子伴侣系统共同进化，导致异源表达效率降低。研究人员开发了一种“返祖突变”策略：通过计算模拟（例如WakoSaito-Munoz-Eaton（bWSME）模型）识别现代蛋白质中折叠效率低下的区域，随后引入祖先突变以精确定位折叠缺陷区域，并通过最小化的祖先突变恢复祖先的自主折叠能力。

分子伴侣的过表达

原核生物已进化出多层次的分子伴侣系统，形成了一个三维质量控制体系，该体系涵盖从核糖体相关伴侣蛋白到周质折叠网络。通过稳定新生多肽、解离错误折叠中间体以及防止毒性聚集体的形成，发挥着维持蛋白质稳态的作用。

细胞质的分子伴侣系统：核糖体关联触发因子（TF）、ATP依赖性DnaK-DnaJ-GrpE（KJE）复合物以及GroEL-GroES（ELS）系统。

细胞外分子伴侣系统：大肠杆菌 的周质空间中，SurA和FkpA兼具双重功能：既可作为肽基-脯氨酰异构酶（PPIases），也可作为分子伴侣。

革兰氏阳性菌（如枯草芽孢杆菌）的胞外分子伴侣蛋白是PrsA脂蛋白，它属于parvulin型PPI酶家族。该蛋白锚定于细胞质膜与细胞壁的界面处，其功能在于促进分泌蛋白的折叠与成熟。

工程化分子伴侣系统：对分子伴侣蛋白进行修饰是提高外源蛋白折叠效率的有效策略，但这些经修饰的分子伴侣可能仅对表现出缺陷的特定外源蛋白有效。这一局限性源于靶向修饰会改变分子伴侣的结构与功能，而这些分子伴侣通常经过优化以协助特定蛋白质的折叠。然而，这种特异性也可能损害它们促进其他蛋白质折叠的能力。

分子伴侣的特异性、兼容性及宿主负担：虽然分子伴侣的共表达可以增强目标蛋白的折叠效率和产量，但这一策略仍主要依赖于经验优化而非预测性设计。进化形成的伴侣蛋白在底物特异性和功能多态性之间保持着微妙的平衡，这是细胞蛋白质稳态的核心机制。

尽管工程化改造的伴侣蛋白变体能够辅助外源蛋白的折叠，但其底物适用性通常较为有限，往往仅对特定目标蛋白有效。此外，表达水平不匹配可能会破坏宿主自身的折叠网络，从而可能引发蛋白质毒性应激反应。因此，精确调控表达动态对于最大化折叠辅助效果、同时最小化细胞内资源竞争和脱靶相互作用至关重要。

向培养基中添加化学伴侣：化学伴侣是小分子化合物，可通过修饰细胞内的折叠环境来促进蛋白质折叠。将化学伴侣添加至培养基中可减少折叠中间体的聚集，并有助于形成稳定的天然构象。例如多元醇起到抑制聚集与构象稳定化的作用；甘氨酸甜菜碱（甜菜碱）、K-谷氨酸和海藻糖，可作为渗透稳定剂，用于维持天然蛋白质的结构完整性。引入特定辅因子和共金属离子蛋白质的精确折叠与稳定性至关重要，有助于维持其正确的构象，并能防止不溶性聚集体的形成。联合使用化学伴侣通常比单独使用添加剂效果更佳。

使用融合标签进行重组蛋白表达

将标签（蛋白质或肽段）与目标蛋白融合，这可以通过多种机制增强蛋白质的折叠、溶解度和产量，包括折叠核的作用、分子内伴侣的作用、伴侣蛋白的募集以及静电排斥力的增强。

经典的蛋白标签：MBP；SUMO；GST；NusA；TrxA等

新兴蛋白质标签：Mistic；Halo-Tags；串联融合的“Spy”标签；XXA融合标签

靶蛋白-蛋白标签兼容性筛选：蛋白质标签的有效性高度依赖于特定的靶蛋白。某些标签在特定蛋白质上表现出优异性能，或仅对有限数量的蛋白质有效。此外，靶蛋白对不同融合标签的响应可能各异，且同一融合标签在不同宿主菌株中也可能产生不同的效果。

融合标签的酶切：如烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶、肠激酶、因子Xa和凝血酶具有多种优势，它可以保持天然的N端结构，效率高。酿酒酵母的SUMO蛋白酶scUlp1的独特作用机制在于识别SUMO的三级结构而非其序列，从而释放出真正的目标蛋白。蛋白水解过程可能因空间位阻 或聚集而失败。即使切割成功，释放出的靶蛋白也可能失去溶解性。

现象通常归因于“可溶性聚集体”：即通过与溶解标签相互作用而保留在溶液中的蛋白质，但缺乏天然的正确折叠状态。

肽标签：除了蛋白质融合标签外，短肽标签也被广泛用于提高目标蛋白的溶解度。这些短肽标签通常由特定的极性、带正电或带负电的氨基酸残基组成。由于其尺寸较小且氨基酸组成重复短肽标签的融合对蛋白质结构或活性的影响通常极小，无需对其进行切割和去除。此外，与较大的标签相比，短肽标签还能减轻宿主的代谢负担。常见的短肽标签有NEXT，P17等。

尽管融合标签技术彻底革新了重组蛋白生产体系，但其成功应用在很大程度上取决于对目标蛋白的生物物理特性及宿主生物体的生物学特性的系统分析。首先，目标蛋白固有的生物物理属性，如表面电荷分布、疏水核心区域以及折叠能垒，决定了标签选择策略。

人工智能与高通量技术

人工智能（AI）、高通量自动化与多组学数据的融合正彻底变革着提升原核系统中重组蛋白溶解度的策略。AlphaFold2 以及RoseTTAFold在结构预测方面表现出更高的准确性。如trRosetta这类新兴模型则通过模拟动态折叠路径来识别多结构域蛋白质中易聚集的区域，并能够进行靶向修饰以提高重组蛋白的折叠效率。例如整合了物理化学性质、氨基酸序列及蛋白质主链结构信息的ProtSolM，可提升溶解度预测能力。PLM_Sol利用改进的数据集并在蛋白质语言模型（PLMs）中引入额外的分类层，以优化溶解度预测结果。

（数据来源 Zhang X, et al.Brief Bioinform. 2024）

不同策略的比较以及选择

在原核系统中，为提高重组蛋白溶解性而采用的多种策略，包括分子修饰、伴侣蛋白共表达、化学伴侣、融合标签及AI驱动技术，每种策略均具有独特的作用机制、优势与局限性。所有优化策略的有效性均高度依赖于目标蛋白的特性、宿主系统及应用需求，并不存在“通用方法”。目标蛋白的特性，如分子量、结构域复杂性（多结构域与单结构域）、二硫键的存在、内在无序性、辅因子需求以及进化来源（真核生物与原核生物），都会显著影响策略的选择。

小结

分子修饰、伴侣蛋白共表达、化学伴侣、融合标签及AI驱动技术，这些促进蛋白表达的方法共同致力于攻克蛋白质错误折叠这一根本难题，即将不溶性聚集体转化为具有功能活性的构象。然而，序列-环境-折叠之间的复杂关系限制了预测的准确性。因此，开发能够将氨基酸序列、微环境与折叠结果相联系的预测模型，并结合高通量筛选与人工智能驱动的设计技术，对于实现高效、理性的蛋白质工程改造、以满足日益增长的复杂生物制剂需求至关重要。